分子克隆技術(shù)是目前實(shí)驗(yàn)室常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，研究者運(yùn)用該技術(shù)能夠?qū)?DNA 片段以體外重組的方式構(gòu)建至載體，研究者運(yùn)用該技術(shù)能夠?qū)NA片段以體外重組的方式構(gòu)建至載體，隨后通過轉(zhuǎn)化操作導(dǎo)入合適的宿主中復(fù)制擴(kuò)增，最后篩選得到滿足實(shí)驗(yàn)需求的載體克隆。

一、 分子克隆實(shí)驗(yàn)方法

分子克隆研究一般需要將特定 DNA 片段插入至載體形成重組質(zhì)粒。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br role="presentation" style="padding: 0px; margin: 0px; color: transparent; position: absolute; white-space: pre; cursor: text; transform-origin: 0% 0%; font-family: Arial; font-size: 16px; background-color: rgb(255, 255, 255);"/>將常見的分子克隆技術(shù)進(jìn)行分類：
·入門克?。篢A 克隆、TOPO 克隆。
·定向克隆：同源重組、酶切連接（黏性末端雙酶切反應(yīng)）。
·定點(diǎn)突變：堿基的插入、缺失與改變。

1.酶切連接

酶切連接作為載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)最標(biāo)志性的技術(shù)，是利用限制性內(nèi)切酶（特指 Type II型限制性內(nèi)切酶）和 T4 DNA 連接酶，完成 DNA 片段 / 載體的重組連接。
限制性內(nèi)切酶依據(jù)結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度、識別序列、切割位點(diǎn)位置及輔助因子要求分為四類，其中 Type II 型限制性內(nèi)切酶可識別特異的雙鏈 DNA 序列，切割位點(diǎn)位于識別序列內(nèi)或臨近識別序列，以內(nèi)切的方式水解核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵，生成特定 DNA 片段（5’ 端為磷酸基團(tuán)，3’ 端為羥基）。

T4 DNA 連接酶可以催化相鄰的 5’磷酸基團(tuán)末端和 3’羥基末端，生成磷酸二酯鍵。

采用酶切連接的方法構(gòu)建載體時(shí)，首先對載體和片段上酶切位點(diǎn)進(jìn)行分析，因載體和片段需要用相同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，因此在選擇酶切位點(diǎn)時(shí)，需要選擇載體上含有的特定酶切位點(diǎn)，而目的片段內(nèi)部不含有該酶切位點(diǎn)（若插入片段內(nèi)部含有該酶切位點(diǎn)，則在使用限制性內(nèi)切酶消化插入片段時(shí)，會將片段內(nèi)部切開）。通過 PCR 的方法在目的片段兩端引入線性化載體對應(yīng)的酶切位點(diǎn)，隨后限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒 / 載體和擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切消化，得到末端序列對應(yīng) / 一致的酶切產(chǎn)物并純化，然后使用 T4 DNA 連接酶對純化的酶切產(chǎn)物（片段與載體）進(jìn)行連接，經(jīng)過感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、篩選等操作，最終得到重組質(zhì)粒。該方法在使用雙酶切線性化時(shí)，可實(shí)現(xiàn)定向克隆，亦可變換所用載體；但有時(shí)會因難以找到適宜的酶切位點(diǎn)及組合，或限制性內(nèi)切酶切割 DNA 效率低下，造成實(shí)驗(yàn)推進(jìn)困難。

2. TA 克隆

TA 克隆是指把 PCR 片段與一個(gè)具有 3 ’-T 突出的載體進(jìn)行連接，經(jīng)過感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、篩選等操作得到重組質(zhì)粒的技術(shù)。利用 Taq DNA 聚合酶非模板依賴的末端轉(zhuǎn)移酶活性在雙鏈 PCR 產(chǎn)物的 3’ 末端添加一個(gè) A 堿基，與使用特殊方法處理的具有 3’-T 突出堿基的線性化載體，通過 T/A 配對及 T4 DNA 連接酶的作用進(jìn)行連接。該方法快捷、高效，但不兼容平末端產(chǎn)物的連接，對于使用高保真酶擴(kuò)增的平末端產(chǎn)物需要額外進(jìn)行加A反應(yīng)。

3. TOPO 克隆

TOPO 克隆是指利用拓?fù)洚悩?gòu)酶的催化作用，完成目的片段與線性載體連接，經(jīng)過感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、篩選等操作得到重組質(zhì)粒的技術(shù)方法。拓?fù)洚悩?gòu)酶的核心酶是 DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶I，具有以下幾大特點(diǎn)：
① 同時(shí)具有限制性內(nèi)切酶和連接酶的功能；
② 80% 的連接反應(yīng)在 2min 內(nèi)完成 ;
③ 不需要外界提供能量。
因此，拓?fù)洚悩?gòu)酶可以切割一條 DNA 鏈并與 3’ 端 T 的磷酸基團(tuán)形成共價(jià)鍵，使 DNA解旋。隨后，通過線性化 DNA 片段的 5’ 端羥基進(jìn)攻形成共價(jià)鍵，該酶從 DNA 上釋放出來。

為了利用拓?fù)洚悩?gòu)酶的這一連接活性，載體首先利用 TOPO 酶線性化處理制備線性TOPO 載體，隨后加入 DNA 片段完成重組連接。據(jù)此，TOPO 實(shí)驗(yàn)的基本原理可簡單理
解為：
① PCR 產(chǎn)物（目的基因）末端的 5 ’-OH 去進(jìn)攻載體 DNA 和 TOPO 酶之間的磷酸鍵；

② TOPO 酶分子被釋放出來，載體與目的基因形成具有雙切刻的環(huán)形重組分子

4. 同源重組

同源重組是指利用重組酶將有末端序列且末端序列一致的兩段序列進(jìn)行重組，形成環(huán)形雙鏈 DNA, 經(jīng)過感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、篩選等操作得到重組質(zhì)粒的技術(shù)方法。
 因此在該系統(tǒng)中，需要預(yù)先創(chuàng)建同源區(qū)域，通過將擴(kuò)增插入片段的正向和反向 PCR 引物 5’ 端外延 15-20bp 堿基，使這些堿基與線性化質(zhì)粒載體的末端序列全部匹配，這樣擴(kuò)增出的插入片段兩端就與線性載體末端序列同源。隨后 Vazyme 的 ClonExpress 同源重組系列核心酶 Exnase，識別這部分同源序列并發(fā)揮重組功能。該方法快速、高效，不依賴酶切和連接，不限制目標(biāo)載體和酶切位點(diǎn)選擇，極易實(shí)現(xiàn)定向克隆。

5. 定點(diǎn)突變

定點(diǎn)突變是指利用 PCR 等方法向目的 DNA 片段（此處特指質(zhì)粒）引入需要的堿基變化，包括堿基的插入、缺失與改變。傳統(tǒng)定點(diǎn)突變系統(tǒng)利用一對反向互補(bǔ)的引物對質(zhì)粒 PCR 擴(kuò)增并退火成環(huán)，突變位點(diǎn)位于引物中間，PCR 擴(kuò)增為非指數(shù)擴(kuò)增，存在模板需求量大、DpnI 消化部分導(dǎo)致的假陽性問題。

MutExpress（Vazyme）點(diǎn)突變系統(tǒng)基于 ClonExpress 快速克隆技術(shù)，利用一對部分反向互補(bǔ)的引物對質(zhì)粒 PCR 擴(kuò)增，使用重組酶針對同源區(qū)域重組成環(huán)。突變位點(diǎn)位于
引物的反向互補(bǔ)區(qū)域，PCR 擴(kuò)增為指數(shù)擴(kuò)增，模板需求量少，DpnI 可以全部消化，具有超高成功率，使得該系統(tǒng)成為快速、高效改變所需堿基變化的強(qiáng)力選擇。

DpnI 消化原始模板質(zhì)粒的原理為：DpnI 特異識別模板 GATC 序列，只有當(dāng) A 堿基被甲基化時(shí)，DpnI 才能進(jìn)行切割。從克隆用化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（DH5α、Fast-T1 等，非甲基化酶缺陷型）提取出的原始質(zhì)粒，可被 DpnI 切割消化；PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物不含甲基化修飾，不會被 DpnI 消化。

二、分子克隆實(shí)驗(yàn)方法的選擇

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兼容平末端產(chǎn)物的連接，對于使用高保真酶擴(kuò)增的平末端產(chǎn)物需要額外進(jìn)行加 A 反應(yīng)。困難。