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    成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層實驗步驟

    發(fā)布時間: 2021-11-05  點擊次數(shù): 1629次
    材料與儀器

    鏈酶蛋白酶E 用D-PBSA配制1%胰蛋白酶和1mmol L EDTA 受精后8h的胚胎 FBS
    LDF基礎(chǔ)培養(yǎng)液 LDF原代培養(yǎng)液 LDF維持培養(yǎng)液 D培養(yǎng)液 Holtfreter緩沖液
    培養(yǎng)瓶

    實驗步驟

    鱒魚胚胎提取物:

    (a)收集胚胎(受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鱒魚種系,在 10°C 條件下飼養(yǎng),或者受精后 3 天的斑馬魚,在 28°C 條件下飼養(yǎng)),在 -80°C 條件下凍存

    (b)為了制備提取物,將約 150 g 胚胎融化后,采用 Tissuemizer 勻漿器(Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上勻漿 2 min

    (c)將勻漿通過數(shù)層紗布過濾后去除絨毛膜,然后在 4°C 條件下離心(20000 g,30 min )

    (d)離心后收集上清液,留下表面的亮橘色脂層

    (e)將上清液移入 1 只新離心管,按操作步驟(c ) 離心

    (f)收集上清液,留下剩余的脂質(zhì),然后在 4°C 條件下超速離心(100000 g,60 min )

    (g)超速離心后收集上清液,留下脂層。用 LDF (1 : 10 ) 稀釋上清液,然后過濾除菌

    (h)提取物過一系列濾器(1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )過濾

    (i)將提取物按 0.5 ml 分裝后,在 -80°C 條件下凍存

    (j)為了用提取物培養(yǎng)細(xì)胞,測量蛋白質(zhì)濃度(見方案 21.4 ),然后用 LDF 將提取物稀釋至理想的工作濃度

    (k)將稀釋的提取物在 4°C 條件下冷藏,最長 2 個月

    BRL 細(xì)胞條件培養(yǎng)液:

    (a)在 37°C 條件下和在 75 cm2 培養(yǎng)瓶中,用 DMEM/F12/10FB 培養(yǎng)液培養(yǎng) BRL 細(xì)胞(ATCC )

    (b)當(dāng)細(xì)胞匯合時,用添加 2% FBS 的 LDF 置換 FD 培養(yǎng)液,在 37°C 條件下培養(yǎng)

    (c)5 天后吸出 LDF,過濾,在 -20°C 凍存

    (d)向細(xì)胞中加入新鮮的 LDF,5 天后重復(fù)此過程。條件化的 LDF 培養(yǎng)液可從同一個培養(yǎng)瓶中收集 3 次。然后,將細(xì)胞分開培養(yǎng),使細(xì)胞再次匯合

    1. 收集約 30 個受精后 8 h 的胚胎。

    2. 通過鏈酶蛋白酶處理,除去絨毛膜 [ Sun et al.,1995a ]。

    3. 用胰蛋白酶孵育胚胎 1 min,同時用吸管輕輕吹打,以便使細(xì)胞分散。

    4. 加入 FBS (終濃度為 10 % ) ,終止胰蛋白酶的消化。

    5. 離心(500 g ,10 min ) ,收集細(xì)胞。

    6. 用 5 ml 含有 PGF 的 LDF 原代培養(yǎng)液混懸細(xì)胞,然后將細(xì)胞移入 25 cm2 培養(yǎng)瓶。

    7. 在 26°C 條件下,讓細(xì)胞貼壁和匯合。

    8. 當(dāng)細(xì)胞匯合時,用同樣的培養(yǎng)液傳代。

    9. 培養(yǎng) 2~3 代后,上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞將混合出現(xiàn)。這些細(xì)胞可用含有 10% FBS 的 LDF 基礎(chǔ)培養(yǎng)液維持培養(yǎng)。通過不同的胰蛋白酶消化,為下一步培養(yǎng)篩選成纖維細(xì)胞。

    (a)用胰蛋白酶處理細(xì)胞 1 min 以除去大部分成纖維細(xì)胞,保留貼在瓶壁上的上皮細(xì)胞。

    (b)將成纖維細(xì)胞移入另 1 個培養(yǎng)瓶。當(dāng)細(xì)胞匯合時,重復(fù)以上過程。

    (c)培養(yǎng) 2~3 代后,細(xì)胞均為成纖維細(xì)胞。

    10. 制備生長抑制的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層:

    (a)將細(xì)胞加入合適的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶,使成纖維細(xì)胞生長成為匯合的單層。

    (b)將 10 μg/ml 絲烈霉素 C 加入成纖維細(xì)胞中,在 26°C 條件下處理 3 h。

    (c)用 LDF 浸洗 3 次后,可將生長抑制的成纖維細(xì)胞用作斑馬魚胚細(xì)胞培養(yǎng)的伺養(yǎng)層。


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