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    報(bào)告基因:β-半乳糖苷酶的原位染色實(shí)驗(yàn)方法

    發(fā)布時(shí)間: 2021-11-05  點(diǎn)擊次數(shù): 1729次
    材料與儀器

    β-gal表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞
    D-PBSA 染色液
    6 孔培養(yǎng)板 恒溫箱 倒置顯微鏡

    實(shí)驗(yàn)步驟


    一、材料
    非消毒物品 


    1. D-PBSA


    2. 底物:X-gal(nvitrogen),以二甲基甲酰胺配成 20 mg/mL,用多聚丙烯管-20℃ 避光保存,最長可達(dá) 6 個(gè)月 


    3. 固定液:1.8% 的甲醛和 0.05% 戊二醛,均以 PBSA 液配制;將 85 mL 水、10 mL 的 10x D-PBSA、5 mL 福爾馬林(37% 甲醛溶液)及 0.2 mL 戊二醛(25% 溶液)混合,制備成固定液,于 4℃ 儲存 


    4. 染色液:含 5 mmol/L 鐵氰鉀,5 mmol/L 亞鐵氰鉀,2 mmol/LMgCl2,以 D-PBSA 配制,4℃ 儲存 


    5. 底物/染色液:1 mg/mLX-gal,以染色液配制,現(xiàn)用現(xiàn)配 


    6. 含 10% 甲醛的 D-PBSA 液 


    7. 將β-gal 的表達(dá)質(zhì)粒作為報(bào)告基因轉(zhuǎn)染(如:pcMV β-gal )


    二、操作步驟:
    1. 用 2 mL D-PBSA 液洗滌細(xì)胞(如在 6 孔培養(yǎng)板上)。


    2. 用 1 mL 固定液于室溫下固定細(xì)胞 5 min。


    3. 用 2 mL D-PBSA 洗滌細(xì)胞 2 次。


    4. 將 1 mL 底物/染色液加入到每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi),37℃ 孵育 2 h。


    5. 用 2 mL D-PBSA 液沖洗每孔細(xì)胞,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞,計(jì)數(shù)藍(lán)染(β-gal 陽性)細(xì)胞。


    6. 培養(yǎng)板的儲存。在每孔加 1 mL 含 10% 甲醛的緩沖鹽溶液,室溫下固定 10 min,然后用緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞,4℃ 儲存緩沖鹽溶液。



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