一、接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按照2×105cells/cm2的細(xì)胞密度接種至包被后的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)皿放到37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞增殖狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)60-70%時(shí)，棄掉上清，加入成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。

二、細(xì)胞分化誘導(dǎo)

每2-3天進(jìn)行換液（定期觀察是否有污染），再放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2-3周，并注意觀察細(xì)胞形態(tài)變化。根據(jù)細(xì)胞鈣鹽結(jié)晶析出和鈣質(zhì)結(jié)節(jié)形成的情況，決定終止細(xì)胞誘導(dǎo)的時(shí)間，進(jìn)行下一步染色鑒定。

三、細(xì)胞固定

用吸頭（確保吸取充分）吸去培養(yǎng)基使用適量1×PBS清洗一次，棄去后取適量4%中性甲醛溶液細(xì)胞培養(yǎng)皿底面，室溫固30-60min，棄去固定液再使用1×PBS清洗兩次。

四、茜素紅染色

加入適量茜素紅染液染3-5min，吸去茜素紅染液，用1×PBS清洗兩次，并加入適量1×PBS避免細(xì)胞干燥。

五、誘導(dǎo)評估

顯微鏡下觀察成骨染色效果，并進(jìn)行圖像采集和誘導(dǎo)評估。誘導(dǎo)成功時(shí)，鈣質(zhì)結(jié)節(jié)會(huì)與茜素紅染料結(jié)合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色。