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    免疫組化結(jié)果分析應(yīng)該注意的一些事項(xiàng)和技巧

    發(fā)布時(shí)間: 2021-09-08  點(diǎn)擊次數(shù): 2262次

    很多時(shí)候,我們千辛萬(wàn)苦地染出了一張張漂亮的免疫組化片子。但是卻不知道如何正確地分析,得出理想的結(jié)果。這實(shí)在是一件憾事。其實(shí),免疫組化結(jié)果分析的 protocol 教科書(shū)和實(shí)驗(yàn)手冊(cè)上面都有。今天主要談?wù)剳?yīng)該注意的一些事項(xiàng)和技巧,并且有獨(dú)門(mén)絕招獻(xiàn)上,都是干貨喲。


    對(duì)照染色 

    和做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候必須設(shè)立對(duì)照組一樣,免疫組化也必須設(shè)立對(duì)照染色。沒(méi)有對(duì)照染色的免疫組化結(jié)果是不可信的。對(duì)照一般有陽(yáng)性組織對(duì)照,陰性組織對(duì)照,陰性試劑對(duì)照,自身對(duì)照。一般來(lái)說(shuō),有一個(gè)陽(yáng)性組織對(duì)照和一個(gè)陰性組織對(duì)照就足夠了。 


    定位 

    抗原表達(dá)必須在特定部位。如 LCA 應(yīng)定位在細(xì)胞膜上;CK 應(yīng)定位在細(xì)胞漿內(nèi);PCNA 及 p53 蛋白應(yīng)定位在細(xì)胞核內(nèi)等等。不在抗原所在部位的陽(yáng)性著色,不能視為確切的陽(yáng)性結(jié)果。有可能是非特異性染色或者假陽(yáng)性。不能確定怎么辦?這就要用到上一段提到的對(duì)照染色了。


    半定位 

    現(xiàn)在一般用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量。如果你的實(shí)驗(yàn)室不幸沒(méi)有那么高大上的話(huà),就只好趕鴨子上架,用肉眼定一下量了。因?yàn)槿藶橹饔^性比較強(qiáng),所以只能稱(chēng)作半定量。免疫組化的半定量一般就分為三級(jí):弱(+),中(++),強(qiáng)(+++)。以綠色免疫熒光為例,則表現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱(+)=1,中(++)=2,強(qiáng)(+++)=3。至少隨機(jī)觀察 5-10 個(gè) HPF。然后根據(jù)(+)% x 1 +(++)% x 2 +(+++)% x 3 計(jì)算出數(shù)值;總數(shù)值 <1.0 者為(+),1.0-1.5 者為(++), >1.5 者為(+++)。


    圖像分析儀 

    如果要進(jìn)行精確定量的話(huà),就要用到圖像分析儀。圖像分析儀類(lèi)型很多。這里就不一一介紹了。其實(shí)最想推薦的是一款圖像分析軟件:Image J。這是 NIH 開(kāi)發(fā)的免費(fèi)軟件。一般的免疫組化結(jié)果分析用它就綽綽有余了。網(wǎng)上可以免費(fèi)下載。其界面非常簡(jiǎn)潔。

    現(xiàn)在,根據(jù)一個(gè)實(shí)例來(lái)看看如何用 Image J 來(lái)進(jìn)行圖像分析。如我們有一張細(xì)胞的免疫熒光染色的照片。那么,如何用 Image J 來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞的個(gè)數(shù)呢?

    首先,要把彩色的圖像轉(zhuǎn)換成黑白圖像。步驟如下:Image→Type→16-bit。轉(zhuǎn)換成黑白圖像后,將要計(jì)數(shù)的部分用高亮標(biāo)示出來(lái)。步驟如下:Image→Adjust→Threshold。然后拖動(dòng)鼠標(biāo),直到所有的細(xì)胞被標(biāo)示出來(lái)。有時(shí)候 2 個(gè)細(xì)胞靠得比較緊密,會(huì)被計(jì)數(shù)為 1 個(gè)細(xì)胞。這個(gè)時(shí)候可以采用 Image J 的水洗功能。步驟如下:Image→Binary→Watershed。這些是本來(lái)計(jì)數(shù)成一個(gè)的細(xì)胞,經(jīng)過(guò)水洗之后,更加精確地被計(jì)數(shù)成了 2 個(gè)細(xì)胞。

    然后,就可以正式開(kāi)始分析了。步驟如下:Analyze→Analyze Particles。在得出最后的結(jié)果之前,還有一些選項(xiàng)需要選擇。如果想要計(jì)數(shù)全部的細(xì)胞,那么 Size 項(xiàng)里面選擇“0-infinity"。 Circularity 的默認(rèn)值為“0.00-1.00"。一般就取默認(rèn)值。軟件自動(dòng)測(cè)量了每個(gè)細(xì)胞的大小。這里因?yàn)槭嵌S圖像,所以就是每個(gè)細(xì)胞的面積。



    免疫組化是個(gè)苦活,時(shí)間長(zhǎng),步驟多,還要經(jīng)常接觸有毒致癌物質(zhì)。大家辛辛苦苦染出了漂亮的片子,最后都希望得出自己想要的結(jié)果。以上介紹了一些心得體會(huì)。希望廣大的同學(xué)們都能做出自己想要的結(jié)果,早點(diǎn)發(fā)文章。

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