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    DNA載體構建——【干貨】三圖讓你秒懂質粒圖譜

    發(fā)布時間: 2021-08-24  點擊次數: 13863次

    很多人拿到一個質粒圖譜,第一反應只能是仰天長嘯,這是什么玩意?這些 ori、RBS、tet 是什么鬼?這些箭頭代表什么,轉錄的方向嗎?為什么都不相同,不會“撞車"么? 來,看幾張圖,上面的問題就能一一破解。


    第一步:先了解質粒的基本組成元素。


    DNA載體構建——【干貨】三圖讓你秒懂質粒圖譜


    1)復制起始點 Ori。該位點決定了質粒的宿主及質粒的拷貝數,它是質粒中一段特定序列,富含 AT 和重復序列。

    Tips:圖譜上只有一個 Ori,表示質粒是原核克隆表達質粒;有兩個 Ori,則表示該質粒是,穿梭質粒,即可在原核也可在真核中復制。

    2)抗性篩選基因。圖譜中 Kan/tet 就是抗生素抗性基因,方便后續(xù)通過抗生素篩選陽性克隆。特點就是單詞最后會以大寫 R 或上標 r 結束。

    Tips:一般克隆載體只有一種抗性篩選標記,部分表達載體及穿梭質粒具有兩種抗性篩選標記。

    3)多克隆位點(MCS),即一系列限制性內切酶酶切位點,是外源 DNA 插入位點,一般可通過酶切/連接方式將外源 DNA 插入質粒,外源 DNA 一般小于 10kb,而片段越長,轉化效率越低。

    Tips: 一般位于轉錄啟動和轉錄終止信號之間;所包含的限制性內切酶位點數量和組成因載體不同會有所差異,且其中的酶切位點在質粒中為單一的酶切位點;同時在使用時需注意質粒載體與外源 DNA 酶切位點的兼容性問題熒光標記或蛋白標簽序列。蛋白純化標簽蛋白:His-Tag,GST-Tag 等;蛋白檢測標簽蛋白:Myc-Tag,Flag-Tag,HA-Tag 等;熒光蛋白表達標簽:GFP,mCherry 等。


    第二步:看質粒是否是表達載體,如果是,那就必定有這些原件:啟動子-核糖體結合位 點-克隆位點-轉錄終止信號。


    DNA載體構建——【干貨】三圖讓你秒懂質粒圖譜

    1、啟動子:促進 DNA 轉錄的 DNA 序列,可與 RNApol 特異性結合。

    2、增強子/沉默子:前者是真核基因組中一種增強鄰近基因轉錄過程的調控順序,其作用與增強子所在位置或方向無關。后者是負增強子,負調控序列。

    3、核糖體結合位點/起始密碼/SD 序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA 有核糖體的兩個結合位點,對于原核而言是 AUG(起始密碼)和 SD 序列。

    4、轉錄終止順序(終止子)/翻譯終止密碼子:結構基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA  的保守序列,此位點 down-stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū),這 2 部分共同構成 poly(A)加 尾信號。


    第三步:弄清楚方向,即為何質粒圖譜上有的箭頭順時針而有的箭頭逆時針。


    DNA載體構建——【干貨】三圖讓你秒懂質粒圖譜

    其實那是代表兩條 DNA 鏈,即質粒是環(huán)狀雙鏈 DNA,它的啟動子等在其中一條鏈上,而它的某些基因在另一條鏈上。當然,最重要的是要弄清楚目的基因插入那一段(從 T7 啟動子到終止子那一段)的方向,即下圖黃色圈圈所示的箭頭方向,其它的大可以忽略。


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